LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

ACARA 5

KULTIVASI DAN ISOLASI

 

Disusun Oleh :

Nama                           : Putri Mian Hairani

NPM                            : E1J012014

Judul Acara                  : Kultivasi dan Isolasi

Hari & tgl Praktikum   : Selasa, 9 April 2013 (14.00-16.00 WIB)

Dosen P.                      : Ir. Mucharromah M.Sc., Ph.D

Co-ass                          : Agung Matsetio

Laboratorium Ilmu Hama PenyakitTanaman

FakultasPertanian

Universitas Bengkulu

2013

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

            Untuk mempelajari suatu jenis mikroorganisme dalam laboraturium, mikroorganisme yang bersangkutan perlu dipisahkan (diisolasi) dari keberadaannya dengan mikroorganisme lain di alam. Kegiatan isolasi biasanya diikuti dengan kegiatan pemurniaan dan perbanyakan. Mikroorganisme yang bersifat saprofit benar, saprofit fakultatif, dan parasit fakultatif dapat diisolasi dengan kultivasi pada medium kultur buatan. Pada mikroorganisme parasit obligat, medium kultur yang digunakan berupa sel hidup, jaringan hidup atau organisme inangnya.           
            Salah satu faktor yang perlu diperhatikan dalam kultivasi mikroorganisme adalah faktor kebutuhan nutrien, disamping faktor-faktor lain yang diperlukan untuk kehidupannya. Cara isolasi dan kultivasi mikroorganisme yang satu dengan lainnya terkadang sangat berbeda dan mengikuti cara-cara tertentu agar mikroorganisme yang diisolasi memang benar-benar terpisah dari keberadaannya dengan mikroorganisme lain dan pertumbuhannyapun seperti yang diharapkan.

            Hal-hal yang harus diperhatikan dalam isolasi dan kultivasi yaitu sebagai berikut :

1.      Semua peralatan dan sarana dalam keadaan steril (bebas mikroorganisme hidup) atau bebas kontaminan (mikroorganisme yang tidak dikehendaki).

2.      Dilakukan secara aseptik (tidak memberi kesempatan untuk terjadinya kontaminasi), misalnya:     
a. Dilakukan di dalam ruangan yang steril     
b. Pembukaan medium kultur seminimum mungkin  
c. Arah pembukaan medium tidak berlawanan dengan arah sirkulasi udara/angin   
d. Setiap langkah selalu memperhatikan tingkat sterilitasnya

Banyak sekali metode isolasi dan kultivasi mikroorganisme, diantaranya metode taruh, gores, dan sebar. Pada medium kultur padat, metode taruh biasanya digunankan untuk kultivasi jamur atau cendawan, sedangkan metode gores dan sebar digunakan untuk kultivasi bakteri.

1.2  Tujuan Praktikum

KULTIVASI & ISOLASI MIKROORGANISME DARI TANAH

·         Melihat macam-macam koloni mikroorganisme yang berasal dari tanah dengan variasi kepekatan tanah

·         Memberikan ketrampilan kepada mahasiswa, agar mampu menumbuhkan dan memisahkan bakteri atau jamur dari keberadaanya di dalam tanah

KULTIVASI & ISOLASI MIKROORGANISME DARI JARINGAN TANAMAN

·         Memberikan keterampilan kepada mahasiswa, agar mampu menumbuhkan dan memisahkan bakteri atau jamur dari asosiasinya dengan tumbuhan

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme sebagai makhluk hidup sama dengan organisme hidup lainnya sangat memerlukan energi dan bahan-bahan untuk membangun tubuhnya, seperti dalam sintesis protoplasma dan bagian-bagian sel lainnya. Bahan-bahan tersebut disebut nutrien. Untuk memanfaatkan bahan-bahan tersebut, maka sel melakukan suatu kegiatan-kegiatan, sehingga menyebabkan perubahan kimia di dalam selnya. Semua reaksi yang teratah yang berlangsung di dalam sel ini disebut metabolisme. Metabolisme yang melibatkan berbagai macam reaksi di dalam sel tersebut, hanya dapat berlangsung atas bantuan dari suatu senyawa organik yang disebut juga biokatalisator yang dinamakan enzim (Djide, 2006).

Peran utama nutrien adalah sebagai sumber energi, bahan pembangun sel, dan sebagai aseptor elektron dalam reaksi bioenergetik (reaksi yang menghasilkan energi). Oleh karenanya bahan makanan yang diperlukan terdiri dari air, sumber energi, sumber karbon, sumber aseptor elektron, sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan nitrogen. “Selain itu, secara umum nutrient dalam media pembenihan harus mengandung seluruh elemen yang penting untuk sintesis biologik oranisme baru (Jawetz, 2001).

Saat ini media agar merupakan media yang sangat umum digunakan dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Media agar ini memungkinkan untuk dilakukannya isolasi bakteri dari suatu sampel, karakterisasi morfologi, sampai penghitungaan bakteri yang dikenal dengan nama total plate count. Bentuk koloni bakteri dan warna-warninya mudah sekali dikenali dengan media ini dengan cara mengubah komposisi nutrien atau menambahkan indikator (Achmad, 2009).

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrien) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat fisiologis dan perhitungan sejumlah mikroba. Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat, antara lain : harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan tumbuh, tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang ditumbuhkan dapat tumbuh dengan baik    (Sutedjo, 1991).

Suatu medium yang mengandung substansi kompleks seperti ekstrak daging sapi, ekstrak khamir, tripton, dan darah disebut sebagai medium buatan atau medium kompleks (artificial or complex medium). Sebagai lawannya, kita acu medium yang rumus kimia masing-masing ramuannya dapat dituliskan sebagai medium sintesis (synthtetical medium) atau medium yang ditentukan (difined medium). Medium sintesis mungkin sangat rumit dan sangat berbeda sesuai dengan organisme tertentu yang hendak ditumbuhkan. Untuk sebagian besar, medium sintesis hanya digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di laboratorium penelitian (Volk & Wheeler, 1993).

Agar-agar, gelatin atau gel silika merupakan bahan untuk membuat medium menjadi padat. Namun, yang paling umum digunakan adalah agar-agar. Meskipun bahan utama agar-agar adalah gelatin, yaitu suatu kompleks karbohidrat yang diekstraksi dari alga marin genus gelidium, namun sebagian mikroorganisme tidak dapat menggunakannya sebagai makanan sehingga agar-agar dapat berlaku hanya sebagai pemadat (Hadioetomo, 1993).

Untuk perhitungan mikroorganisme mungkin yang paling sering digunakan adalah prosedur penumbuhan dalam agar. Secara sederhana suatu contoh suspensi sel atau bahan pangan homogenat diinokulasi ke dalam atau ke atas media nutrien agar dan setelah diinkubasi, jumlah koloni yang terbentuk dihitung. Karena satu koloni menunjukkan jumlah sel dalam larutan asalnya (Buckle, 1985).

Perhitungan secara penumbuhan dalam cawan petri dapat dilakukan dengan menggunakan tiga metode yaitu : dalam metode penuangan, 1,0 ml contoh dipindahkan ke dasar cawan dan dituangkan diatasnya 15-20 ml media agar yang telah didinginkan sampai 45^o – 50^oC dan dicampur serata mungkin. Setelah inkubasi, koloni baik yang tumbuh di dalam agar atau dipermukaannya dihitung. Prosedur ini termasuk yang paling peka, sampai sejumlah 20 sel/ml dapat dihitung. Metode ini tidak dapat diterapkan dalam studi lapangan karena dibutuhkan alat-alat untuk mencairkan dan mendinginkan media agar. Berikutnya metode penyebaran pada permukaan cawan dilakukan dengan menggunakan 0,1 ml larutan contoh disebaratakan di permukaan media agar yang tersedia dengan tongkat gelas yang melengkung (bent glass rod) yang telah disterilkan. Setelah inkubasi, koloni yang tumbuh di permukaan dari media dihitung. Karena penggunaan volume larutan yang sedikit yaitu 0,1 ml, maka kepekaannya sekitar 300 sel/ml. Oleh karena media agar dalam cawan telah disiapkan lebih dahulu, maka metode ini dapat diterapkan dalam studi lapangan. Dan terakhir adalah metode penetesan pada cawan, media yang dipersiapkan terlebih dahulu dibagi-bagi menjadi 3 atau 4 sektor dan setetes larutan contoh (0,02 ml) dipindahkan ke masing-masing sektor. Setelah tetesan tersebut dibiarkan kering, cawan petri kemudian diinkubasi. Suatu pipet penetes yang telah dikalibrasi dipergunakan untuk mengukur dan memindahkan tetesan. Pengenceran contoh diatur sedemikian rupa sehingga diperoleh antara 5 sampai 20 koloni terbentuk dari setiap tetesan pada permukaan media agar. Satu keuntungan metode ini adalah bahwa perhitungan dapat dilakukan 3-4 kali ulangan sekaligus dalam satu cawan, sehingga dapat menghemat bahan-bahan untuk uji mikrobiologi. Contoh bahan yang mengandung sekecil 250 sel setiap ml masih dapat dihitung dan teknik ini dapat diterapkan dalam percobaan-percobaan lapangan (Buckle, 1985).

BAB III

BAHAN DAN METODE PRAKTIKUM

KULTIVASI & ISOLASI MIKROORGANISME DARI TANAH

3.1 Bahan dan Alat

Bahan : Medium kultur (PDA), + NaCl 50% + Na₂CO₃ 10%, Asam Asetat 1%  alkohol                  aquades, tanah rizosfir

Alat     : Waterbath, cawan petri, gelas ukur, gelas erlenmeyer, tabung reaksi, batang
              pengaduk, lampu spiritus, entcase, stopwatch, timbangan, ruang inkubasi

3.2 Prosedur Kerja

·           Medium kultur (PDA) dipanaskan di dalam waterbath sampai mencair

·           Contoh tanah ditimbang seberat 10 gr pada gelas arloji atau aluminium foil, kemudian dimasukkan ke dalam gelas erlenmeyer 200 mL steril.

·           Tanah 10 gr ditambah air steril sampai menjadi 100 mL dan dikocok samapai homogen, sehingga diperoleh suspensi tanah berkonsentrasi 10^-1

·           Siapkan 5 tabung reaksi steril masing-masing diisi 9 mL aquades steril

·           Suspensi 10^-1 dipipet sebanyak 1 mL kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi 1 yang telah berisi 9 mL air steril kemudian dikocok sampai homogen, untuk mendapatkan pengenceran 10^-2

·           Suspensi 10^-2 dipipet sebanyak 1 mL kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi 2 yang telah berisi 9 mL air steril kemudian dikocok sampai homogen, untuk mendapatkan pengenceran 10^-3

·           Hal yang sama dilakukan pada tabung 3, 4, dan 5 untuk mendapatkan pengenceran 10^-4, 10^-5, dan 10^-6

·           Siapkan 4 cawan petri steril

·           Cawan petri steril dituangi 250µL NaCl 50% dan 125µL Na₂CO₃ 10% untuk menghambat pertumbuhan jamur tanah

·           Kemudian dituangi 250µL (±2 tetes) asam asetat 1% untuk menghambat pertumbuhan bakteri tanah, kemudian diisi dengan PDA sebanyak 12 mL

·           Setelah medium membeku, masing-masing medium dalam cawan petri ditetesi 100µL suspensi tanah dari pengenceran yang berbeda-beda, yaitu 10^-3 dan 10^-6, kemudian diratakan dengan menggunakan tabung gelas bentuk L. Langkah ini juga dilakukan di atas nyala lampu spiritus, di dalam entcase atau laminer air flow

·           Cawan petri kemudian diinkubasikan pada suhu kamar dalam keadaan tetap tertutup dan terbungkus

·           Setelah 2 hari, diamati kenampakan koloni, bentuk koloni, warna koloni, berapa jumlahnya dan gambar skematis

KULTIVASI & ISOLASI MIKROORGANISME DARI JARINGAN TUMBUHAN

3.3 Bahan dan Alat

Bahan : Medium kultur TSA, aquades steril, alkohol 90%, kapas, jaringan tanaman yang  
  busuk

Alat     : Waterbath, cawan petri, lampu spiritus, entcase, skalpel, pinset, kertas saring steril,             ruang inkubasi

3.4 Prosedur Kerja

·           Permukaan bagian tanaman yang menunjukkan adanya asosiasi dengan mikroorganisme dibersihkan dari kotoran-kotoran yang menempel, kemudian diseka dengan kapas beralkohol

·           Bagian tanaman dipotong-potong sebersar ±0,5 cm³ dengan skalpel steril pada batas bagian yang berasosiasi

·           Siapkan cawan petri steril berisi kertas saring basah

·           Masukkan potongan jaringan ke dalam cawan petri yang berisi kertas saring basah, kemudian inkubasikan selama 72 jam

·           Setelah 72 jam, koloni yang tumbuh pada potongan jaringan dipindah ke medium baru untuk dimurnikan kemudian diinkubasikan lagi selama 72 jam

·           Setelah 72 jam berikutnya diamati kemurnian koloni, kenampakan koloni, bentuk koloni, ukuran koloni, morfologi mikroskopisnya dan digambar skematis

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

KULTIVASI & ISOLASI MIKROORGANISME DARI TANAH

PENGAMATAN KE-	GAMBAR	KETERANGAN
1		Umur  : 2 hari Ada terdapat banyak hifa yang tumbuh pada hari ke-2. Namun antara koloni hifa yang satu dengan yang lainnya masih menyatu. Tidak begitu jelas pembatas antara satu dengan yang lainnya. Tetapi sudah ada yang terlihat sebagai kontaminan. Yaitu yang koloninya menyediri dari koloni yang lainnya.
2		Umur : 4-5 hari Pada hari ke 4-5 ini, koloni hifa sudah lebih jelas kelompoknya. Tidak seperti pada hari ke-2. Jumlah koloni: Pada cawan petri yang berbentuk bulat, maka dibuat garis bayang yang membagi 2 bagian sama besar, kemudian di buat lagi garis yang menyilang sebanyak 3. Sehingga ada 8 kolom. Untuk memperoleh persen koloni, maka jumlah koloni pada setiap kolom dibagi dengan jumalah kolom dan dikali 100%. Pada bagian pertama: Pada bagian kedua: Dst...

KULTIVASI & ISOLASI MIKROORGANISME DARI JARINGAN TUMBUHAN

PENGAMATAN KE-	GAMBAR	KETERANGAN
1		Umur biakan : 2 hari Pada hari ke-2 ini, belum begitu terlihat mikroba yang tumbuh pada media biakan.
2		Umur biakan : 4-5 hari Pada hari ke 4-5 ini, sudah terlihat adanya mikroba yang tumbuh pada media biakan. Terlihat hifa berwarna hijau yang ada mengelilingi tiap potongan jaringan daun tumbuhan.

4.2 Pembahasan

Setelah medium kultur baik medium PDA dan medium TSA dipanaskan hingga mencair, medium PDA dan TSA cair dituangkan ke dalam cawan petri diatas nyala lampu spiritus di dalam laminar air flow. Kemudian cawan petri digoyang pelan-pelan hingga medium merata kemudian diamkakan hingga membeku. Setelah itu, cawan petri yang satu berisi PDA dan satu berisi TSA dibuka 5 detik dan tutup kembali dengan memeberi label. Dua cawan petri yang satu berisi PDA dan satu berisi TSA selama 30 detik dan tutup kembali dengan diberi label. Kemudian dua cawan petri yang satu berisi PDA dan yang lain berisi TSA  dibuka dengan memberi label. Setelah itu, semua cawan petri diinkubasikan dalam suhu kamar dalam keadaan tetap tertutup dan terbungkus. Lalu tunggu hingga dua hari berikutnya untuk diamati.

Setelah dua hari, pada masing-masing  Medium kultur baik PDA dan TSA akan tampak koloni-koloni seperti debu. Walaupun telah tampak koloni, tetapi masih samar-samar untuk diamati. Pada medium PDA menumbuhkan koloni jamur, sedangkan medium TSA menumbuhkan koloni-koloni bakteri. Pada medium PDA, telihat bentuk jamur yang menyerupai hifa jamur dengan memiliki warna putih yang transparan. Pada medium PDA hanya memiliki satu koloni jamur. Pada medium kultur TSA yang membentuk berbagai koloni-koloni bakteri, tetapi pada cawan petri belum bisa terlihat baik secara bentuk koloni, jumlah koloni, maupun warna koloni. Ini mengindikasikan bahwa pada medium kultur TSA belum bisa tumbuh dalam waktu dua hari.

Pada hari kelima pengamatan, medium kultur PDA memperlihatkan koloni jamur dengan sangat jelas. Ciri-ciri koloni jamur yang dimurnikan pada medium kultur PDA ini adalah :

·         Memiliki bentuk bulat seperti hifa jamur.

·         Pada jamur terlihat adanya garis lurus sejajar.

·         Jamur memiliki warna putih.

·         Jamur yang dimurnikan berjumlah satu pada medium PDA.

Untuk medium kultur TSA yang seharusnya memperlihatkan berbagai koloni-koloni bakteri tidak tampak. Pada cawan petri yang didalamnya berisi medium TSA ini hanya terlihat goresan yang telah digores untuk menumbuhkan koloni-koloni bakteri. Ini berarti, medium kultur TSA tidak ditumbuhi oleh bakteri karena adnya beberapa faktor kemungkinan, yaitu :

·         Terjadi kesalahan dalam proses isolasi.

·         Medium yang ditumbuhkan tidak terdapat bakteri karena menumbuhkan bakteri lebih sulit dibanding menumbuhkan jamur.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

·         Untuk mikroba yang berasal dari tanah beraneka macam, dan memiliki koloni yang lebih banyak daripada yang berasal dari jaringan daun tumbuhan

·         Untuk jenis dan kepekatan tanah tertentu memiliki jenis yang bermacam pula dari mikroba

·         Mikroba yang barasal dari jaringan daun tumbuhan cenderung sedikit daripada jenis dari tanah

·         Untuk mikroba yang berasal dari jaringan daun tumbuhan, lebih lama tumbuh di banding dari tanah yang dalam 2 hari langsung dapat terlihat hasilnya

5.2 Saran

·         Sebaiknya sebelum melakukan praktikum, para praktikan harus lebih paham mengenai teori materi ajarnya

·         Untuk jumlah siswa tertentu, sebaiknya di gunakan tempat yang lebih memadahi lagi

·         Sebaiknya penggunaan alat-alat yang ada di laboratorium itu lebih seksama agar bisa fasih dalam penggunaannya.

DAFTAR PUSTAKA

·         Buckle, K. A. 1995. Ilmu Pangan. Press, Jakarta

·         Dinoto, Achmad. 2009. Kinetika dan Sterilisasi Mikrobiologi. http://www.che.itb.ac.id/download/modul.pdf (diakses pada tanggal 13 April 2013)

·         Djide, M., dan Sartini. 2006. Mikrobiologi Farmasi Dasar. Universitas Hasanuddin, Makassar.

·         Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.

·         Jawetz. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Salemba Medika. Jakarta.

·         Purnomo, Bambang, 2011. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Fakultas Pertanian UNIB. Bengkulu.

·         Sutedjo. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta. Jakarta.

·         Volk, W. A & Wheeler, M. F. 1993. Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi ke 5. Erlangga, Jakarta.